Зиехл-Неелсен Стаин фондација, реагенси и техника

Тхе Зиехл-Неелсен мрља у техници бојења за идентификацију микроорганизама отпорних на алкохол и киселине (ААР). Назив ове микробиолошке процедуре односи се на ауторе: бактериолог Франз Зиехл и патолог Фриедрицх Неелсен.

Ова техника је врста диференцијалне обојености, која подразумијева употребу различитих бојила како би се створио контраст између структура које желите проматрати, разликовати и касније идентифицирати. Зиехл-Неелсен мрља се користи за идентификацију одређених врста микроорганизама.

Неки од ових микроорганизама су микобактерије (на пример, Мицобацтериум туберцулосис), нокардије (на пример, Ноцардиа сп.) и неки једностанични паразити (на пример, Цриптоспоридиум парвум). Многе бактерије се могу класификовати кроз уобичајену технику названу Грам боја.

Међутим, неке бактеријске групе захтевају друге методе да их идентификују. Технике као што је Зиехл-Неелсен бојење захтевају комбинације боја са топлотом да би се прва фиксирала на ћелијски зид.

Затим долази до процеса дисколорације који омогућава два резултата: отпорност или осетљивост на дисколорацију киселина и алкохола.

Индек

• 1 Фоундатион
  • 1.1 Секундарно бојање
• 2 Реагенса
  • 2.1 Примарно бојање
  • 2.2 Раствор за обезбојење
  • 2.3 Секундарно бојање (анти-колорант)
• 3 Техника
  • 3.1. Поступак бојења брзим киселинама
• 4 Референце

Фоундатион

Основа ове технике бојења заснива се на својствима ћелијског зида ових микроорганизама. Зид формира врста масних киселина које се називају миколичне киселине; Оне се одликују веома дугим ланцима.

Када масне киселине имају веома дугу структуру, могу лакше да задрже боје. Неке врсте бактерија је веома тешко обојити Грам бојом, због високог садржаја миколне киселине у ћелијском зиду.

У Зиехл-Неелсен боји, користи се фенолна једињења царбол фуцхсин, основна боја. Ово има способност интеракције са масним киселинама ћелијског зида, што је воскаста текстура на собној температури.

Царбол фуцхсин бојење је побољшано у присуству топлоте, јер се восак топи и молекули боје се брже крећу у ћелијски зид.

Киселина која се користи касније служи да обезбоји ћелије које нису обојене јер њихов зид није био довољно повезан са бојом; према томе, јачина деколоризатора киселине је у стању да уклони киселинску боју. Ћелије које се опиру овој промени боје називају се отпорне на киселине.

Сецондари цолоринг

Након дисколорације узорка, ово је у супротности са другом бојом званом секундарна боја. Углавном се користи метиленско плава или малахит зелена.

Секундарна боја боји позадински материјал и, сходно томе, ствара контраст структурама које су обојене у првом кораку. Само обојене ћелије апсорбују другу боју (анти-мрље) и узимају боју, док ћелије отпорне на киселину задржавају црвену боју.

Ова процедура се често користи за идентификацију Мицобацтериум туберцулосис и Мицобацтериум лепрае, које се називају бацили брзо-киселински.

Реагенси

Примари цолоринг

Користи се карбоксин 0,3% фуксин (филтриран). Ова боја се припрема из мешавине алкохола: фенола у етанолу (90%) или метанола (95%), ау овој смеши се растварају 3 грама базичног фуксина..

Децолоризинг солутион

У овом кораку можете користити растворе 3% алкохолне киселине или 25% сумпорне киселине.

Секундарно бојање (анти-колорант)

Боја која се најчешће користи за извођење контраста у узорцима је обично 0,3% метиленско плаво. Међутим, могу се користити и други, као што је 0,5% малахит зелено.

Техника

Поступак бојења са брзим киселинама

Припремите бактеријски размаз

Овај препарат се прави на чистом и сувом поклопцу, пратећи мере предострожности.

Сушење мрље

Пустите да се размаз исуши на собној температури.

Загрејте узорак

Узорак се мора загрејати паљењем слајда испод. Фиксација алкохолом се може урадити када се размаз не припреми са спутумом (третиран натријум хипохлоритом да би га побелио) и ако се неће одмах обојати..

М. туберцулосис Уклања се избељивачем и током процеса бојења. Термофиксовање нетретираног спутума неће убити М. туберцулосис, док је фиксација алкохолом бактерицидна.

Покриј мрљу

Мрља је покривена раствором карбол фуцхсин (примарна основна мрља).

Загрејте мрљу

Ово се ради 5 минута. Треба да приметите отпуштање паре (приближно 60 ° Ц). Важно је да се не прегреје и избегава паљење узорка.

Што се тиче загревања мрље, велика пажња мора да се обрати када се греје фуксин царбол, нарочито ако се бојење врши на пладњу или другом контејнеру у коме су из претходне мрље сакупљене лако запаљиве хемикалије..

Испод слајдова треба нанети само мали пламен уз помоћ упаљеног бриса који је претходно навлажен са неколико капи киселог алкохола, метанола или 70% етанола. Избегавајте да користите велики обрисак натопљен етанолом јер је то опасност од пожара.

Оперите мрљу

Ово прање треба да се обавља чистом водом. Ако вода из славине није чиста, оперите размаз филтрираном или дестилованом водом, по могућности.

Покријте размаз киселим алкохолом

Овај киселински алкохол треба да буде 3%. Покривеност се врши 5 минута или док размаз не буде довољно избледела, тј. Бледо ружичаста.

Мора се узети у обзир да је киселински алкохол запаљив; стога се мора користити врло пажљиво. Избегавајте да будете близу извора паљења.

Оперите мрљу

Прање треба да буде са чистом, дестилованом водом.

Покријте мрљу бојом

Може бити зелена малахит (0,5%) или метиленско плава (0,3%) боја за 1 или 2 минута, користећи најдуже време ако је размаз танак.

Оперите мрљу

Чиста вода се мора поново користити (дестилована).

Драин

Полеђина слајда треба очистити и мрљу треба ставити на дренажну полицу, тако да се осуши на ваздуху (немојте користити упијајући папир за сушење).

Прегледајте размаз у микроскопу

Потребно је користити објектив 100Кс и уље за урањање. Систематски анализирајте размаз и запишите релевантна запажања.

Интерпретирајте резултате

Теоретски, микроорганизми који су обојени црвенкастом бојом сматрају се позитивном киселином (ААР +).

Напротив, ако су микроорганизми обојени плавом или зеленом бојом, у зависности од боје која се користи као контра-боја, сматрају се негативном киселином отпорном на алкохол (ААР-).

Референце

1. Апурба, С. и Сандхиа, Б. (2016). Ессентиалс оф Працтицал Мицробиологи (1. изд.). Јаипее Бротхерс Медицал Публисхерс.
2. Бауман, Р. (2014). Микробиологија са болестима по телу (4. издање). Пеарсон Едуцатион, Инц..
3. Херитаге, Ј., Еванс, Е. & Киллингтон, А. (1996). Уводна микробиологија (1. изд.). Цамбридге Университи Пресс.
4. Морелло, Ј., Гранато, П. Вилсон, М. & Мортон, В. (2006). Лабораторијски приручник и радна књига у микробиологији: апликације за негу пацијената (11. изд.). МцГрав-Хилл Образование.
5. Васантхакумари, Р. (2007). Тектбоок оф Мицробиологи (1. изд.). Б.И. Публикације ПВТ.