Вригхтова основа, материјали, техника и употреба



Тхе Вригтхова мрља је техника бојања коју је створио амерички патолог Јамес Хомер Вригхт 1902. године, из мрље Романовског. Као што је мрља Романовског била нестабилна, Вригтх је укључио метанол као растварач и фиксатив.

Ова боја је полихроматична, што значи да генерише неколико боја у зависности од структуре коју боја апсорбује. Ова техника бојења је широко коришћена за вршење диференцијалних броја белих крвних зрнаца и проучавање морфологије црвених крвних зрнаца, тромбоцита и леукоцита у периферној крви и коштаној сржи..

Његова примена је веома важна, пошто се абнормалности могу видети у различитим ћелијским линијама крви, што олакшава дијагнозу болести као што су леукемија или бактеријске или паразитске инфекције..

Можда су то најчешће примене у којима се ова техника користи, али нису једине. Такође је користан у узорцима осим крви и коштане сржи, као што су узорци назалног исцједка, фекалне слузи, спутума, коже, између осталих..

Индек

  • 1 Основа Вригхтове мрље
  • 2 Материјали
    • 2.1 Припрема
    • 2.2 Буфицирани раствор пуфера
    • 2.3 Додатни материјали потребни за обављање обојења
  • 3 Компоненте Вригхтове мрље
    • 3.1 Метанол
    • 3.2 Амортизер
    • 3.3 Еосин (И)
    • 3.4 Метиленско плаво
  • 4 Техника
  • 5 Утилити
    • 5.1 Хематологија
    • 5.2 Излучивање носа
    • 5.3 Паразитологија
    • 5.4 Респираторне инфекције
    • 5.5 Бактериологија
    • 5.6 Мицологи
  • 6 Како се посматрају структуре узорка крви са Вригхтовом мрљом??
  • 7 Препоруке за добро бојење
  • 8 Уобичајене грешке у Вригтх боји
    • 8.1 Веома бледо бојење
    • 8.2 Преципитати боје
    • 8.3 Размазати изузетно црвенкастом или плавом бојом
  • 9 Режим складиштења
  • 10 Референце

Вригхтова основа за мрље

Рајтова мрља је настала од мрље Романовског, који се састоји од раствора метилног алкохола из киселинске боје (еозин И) и базичног (метиленско плаво) и његових оксидационих продуката..

Мешавина боја која се користи у Вригхтовој боји узрокује ефекат познат као Романовски, то јест, даје лепу љубичасту боју језграма леукоцита и неутрофилним гранулама, док су црвене крвне ћелије обојене ружичасто..

Компоненте одговорне за давање распона боја типичних за Вригхтову боју су плава Б и еозин И. Уочени ефекат ће зависити од везивања бојила за хемијске структуре и интеракција плавог Б и еозина И.

Киселе структуре као што су нуклеинске киселине, нуклеарни протеини и реактивна незрела цитоплазма неких типова ћелија, фиксни плави Б (основна боја).

Док основне структуре као што је хемоглобин, грануле сегментираних еозинофила, међу осталим ћелијским структурама, фиксирају еозин И (киселинска боја).

На резултат бојења могу утицати различити фактори, као што је пХ Вригхт боје, пуфер и раствор за испирање; као и време бојења и фиксирања.

Стога је сваки корак у припреми реагенса пресудан и мора се урадити водећи рачуна о сваком детаљу.

Материјали

Вригхт цолоринг. За 100 мЛ је потребно:

Измерити 0,3 грама Вригхт боје, измерити 97 мл метанола и 3 мл глицерола.

Препаратион

У малтер, ставите тешку количину Вригхтове боје и полако додајте глицерол док се прах потпуно не отопи..

Затим се додаје метанол, меша и сипа у ћилибарску боцу.

Пре употребе раствор треба протрести са благим покретима и филтрирати.

Буфферед буффер

У литру дестиловане воде, 3,76 г динатријум хидрофосфата (На2ХПО4   2Х20) плус 2.1 гр калијум дихидроген фосфата (КХ)2ПО4).

Мешати веома добро док се сви уграђени реагенси не растворе. Подесите пХ на 7,2. Сипајте у стаклену посуду и чувајте на собној температури.

Додатни материјали потребни за бојење

Додатно, други материјали су потребни за обављање технике бојења, то су: листови који носе предмете или покривају објекте, мост боје, писетас са водом или пуфером за прање, штоперицу за узимање времена бојања и неки материјал за сушење (упијајући папир, газа или памук).

Компоненте боје Вригхт

Метанол

Алкохол (метанол) служи као фиксатив за размаз крви на слајду.

У основи, то је редукциони реагенс, дехидратор и фиксатор за коагулацију. Стога, његова функција је да коагулира протеине и учини их нерастворљивима, али без да их денатурирају.

Метанол је најкориштенији реагенс за фиксирање размаза у свим лабораторијама, јер даје боље резултате од оних добивених етанолом. Идеална концентрација је 99%.

Амортизер

Пуфер (пуферовани раствор) има функцију подешавања или одржавања пХ боје, пошто је пХ подешен на 7.2 неопходан за ћелијске структуре да апсорбују боје.

С друге стране, пролазак метанолске фиксације дехидрира ћелије и пуфер помаже да их се рехидрира.

Еосин (И)

Еозин има афинитет према основним компонентама јер је то кисела боја. Два типа еозина су веома слична један другом, тако да се може користити једно од два, добијајући исти резултат.

Један се зове еозин И, жути еозин или тетрабромофлуоресцеин и други еозин Б, плавкасти еритрозин Б или дибромодинитрофлуоресцеин. Међутим, еозин И је најчешће коришћен.

Најважнија особина ове боје је њена негативна поларност, што је чини привлачном ћелијским структурама са позитивним набојем.

Метхилене блуе

То је основна боја. Његова главна особина је метахромазија, то јест, неће све структуре бити обојене истом бојом, то зависи од хемијског састава структура које он боји..

Неки ће постати светли или тамно плави, а други тамно љубичасти или бледо јорговани.

Техника

1-Проведите распростирање узорка тако да остане танак филм, било на слајду или покривачу.

2-Оставите ваздух да се суши око 2 сата.

3 - Ставите суву мрљу на мрљу за бојење или на носачу за бојење са узорком који се шири горе.

4-Покријте плахту Вригхт бојом кап по кап док не прекрије цијелу површину. Оставите да стоји 5 - 8 минута.

5-Боја треба да потпуно покрије клизач, без просипања преко ивица. Ако се током времена бојења почне испаравати, треба поставити додатне капи.

6-Након тога додајте једнаку количину амортизера, мало удишите док се не појави карактеристичан металик сјај. Узмите 10 до 15 минута.

7-Оперите водом из славине, стављајући мекани млаз све док лист не постане ружичаст.

8-Са газом импрегнираном алкохолом уклоните боју причвршћену на задњу страну клизача.

9 - Пустите да се размаз добро осуши пре стављања уљног уља за визуелизацију у микроскопу.

Утилити

Хематологија

Идеалан је за размазивање размаза периферне крви, за испитивање дебелих крвних размаза и за проучавање ћелија из узорака коштане сржи..

Због хемијских особина ове комбинације боја, ћелијске структуре се могу лако препознати, јер су у стању да разликују различите типове присутних ћелија..

Назална секреција

Ова техника је веома корисна за идентификацију ћелија назалне секреције (епителне ћелије, сегментирани еозинофили, полиморфонуклеарни) у дијагностици алергијског ринитиса..

Паразитологија

У том смислу, било је корисно за проучавање Леисхманиа сп унутар хистиоцита поткожног ћелијског ткива у улцерима коже. Исто тако, користи се за идентификацију леукоцита у узорцима столице (фекални леукограм).

У овом случају, од интереса је за доктора да зна да ли је леукоцитоза присутна у фецесу полиморфонуклеарним или мононуклеарним. Овај налаз у фекалном леукограму ће водити ако је то бактеријска или вирусна инфекција.

С друге стране, паразити који циркулишу у крви могу се наћи унутар еритроцита или слободни у плазми. Жељени паразити су Пласмодиум спп., Трипаносома црузии и филарије, ау ветеринарској медицини је корисна у потрази за Тхеилериа екуи и Бабесиа цабалли, узрочника беба, нарочито код копитара.

Вригхт и Гиемса боја могу разликовати хемопаразите од нормалних станичних компоненти. У ту сврху можете користити два типа ширења:

Фине стретцхес

Крв се шири попут танког филма на слајду. Обојено са Вригхтовом мрљом, откривајући карактеристике језгра и цитоплазме.

Тхицк дроп

Ова методологија се користи за испитивање присуства паразита у већој количини крви.

За то се на слајд ставља велика кап крви. Када стигнете тамо, требали бисте дефибринирати, чинећи веће и веће кругове од центра према ван, користећи ивицу другог слајда.

Коначно, како би се посматрали паразити у дебелом размазу, еритроцити се морају лизирати водом..

Респираторне инфекције

На респираторном нивоу ова техника је такође корисна, јер су ћелије присутне у узорцима спутума, бронхијалном или бронхоалвеоларном испирању, важне за успостављање дијагнозе..

Исто тако, овде се могу разликовати полиморфонуклеарне ћелије и мононуклеарне ћелије.

Бацтериологи

Употреба ове технике у бактериологији је ограничена, јер није добра за бојење бактерија, због чега се за бојење њих користе друге специјализоване технике бојења..

Међутим, користи се за тражење епителних ћелија са инклузионим телима Цхламидиа трацхоматис у размазу уретралне или ендоцервикалне слузнице, мада се мора признати да то није најбољи метод за.

Такође је могуће посматрати спиралне бактерије међу црвеним крвним зрнцима као Боррелиа бургдорфери код заражених пацијената, као и морула или инклузионих тела Ехрлицхиа сп у цитоплазми лимфоцита, моноцита или неутрофила у размазу крви.

Мицологи

Тхе Хистопласма цапсулатум је патогена гљивица која се често дијагностикује микроскопским посматрањем различитих узорака ткива, обојених Вригхтовом бојом.

Како се посматрају структуре узорка крви са Вригхтовом мрљом?

Препоруке за добро бојење

Продужење узорака крви треба спонтано осушити на ваздуху. Размази треба да буду што је могуће тањи да би се постигла боља фиксација боје и избегло прекомерно прекривање.

За висококвалитетно бојење, препоручљиво је да се бојење врши током два сата након припреме размаза. С друге стране, идеалан узорак је капиларна крв, без антикоагуланта.

Међутим, ако се користи венска крв, она се треба користити као ЕДТА антикоагулант, а не као хепарин, будући да она може деформисати ћелијске структуре.

Да би се спречило пропадање, припремљено бојило треба чувати на сувим местима.

Током процеса прања препоручује се употреба воде прилагођене неутралном пХ.

На крају, препоручљиво је тестирати методе бојења које се често користе у лабораторији.

То се ради бојањем узорака или проширених узорака, као контрола квалитета. Овај корак је важан, јер то осигурава да је бојење правилно припремљено и да су времена бојења добро стандардизована.

Ако је лист обрасца лоше обојен, онда постоје проблеми који се морају решити.

Уобичајене грешке у Вригтх боји

Веома бледо бојење

Веома бледе мрље, обично због веома кратког периода бојења или веома претјераног прања. Исправља се продужавањем времена контакта са бојом или смањењем времена прања.

Дие преципитатес

Присуство преципитата боје у размазу може имати неколико узрока, међутим, најчешћи узроци су: употреба нефилтриране боје, бојење на неравним мостовима за бојење, употреба прљавих листова са прашином или масноћом, без доброг прања. Заврши бојење.

Размажите изузетно црвенкастом или плавом бојом

Пуфер је одговоран за пХ боје. Боје са пХ испод назначене (киселине) ће резултирати врло црвеним размазима.

Ако је пХ боје изнад (алкална), добија се изузетно плавкасти размаз.

Режим складиштења

Реагенс треба чувати на собној температури.

Референце

  1. Гутиеррез В. Компаративна студија између Вригхтове методе бојења и Елиса теста за дијагнозу Ехрлицхиосис цанина у граду Сан Педро Сула, Хондурас. 2008. Дипломски рад за пријаву на звање Ветеринарског лекара. Универзитет Сан Царлос де Гуатемала.
  2. Лопез-Јацоме Л, Хернандез-Дуран М, Цолин-Цастро Ц, Ортега-Пена С, Церон-Гонзалез Г, Франко-Цендејас Ф. Основно обојење у микробиолошкој лабораторији. Истраживање о инвалидности. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Вригхтова мрља." Википедиа, Тхе фрее енцицлопедиа. Мај 18 2018, 12:05 УТЦ. 8 Дец 2018, 20:37
  4. Цалдерон А, Цардона Ј, Вергара. Фрекуенци оф Бабесиа спп. у коњима монтериа, Цордоба (Колумбија). Рев. удцаацтуал дивулгицент.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А (2009). Микробиолошка дијагностика Баилеи & Сцотт. 12 ед. Аргентина Панамерицана С.А Уводник.
  6. Ретамалес Е, Мазо В. Институт за јавно здравље Владе Чилеа. Препоруке за бојење размаза крви за читање крвне слике.