Темељ, материјали, техника и употреба за бојење по Граму

Тхе Грам стаин је најједноставнија и најкориснија техника бојења у дијагностичкој микробиологији. Ову технику је осмислио дански лекар Ханс Цхристиан Грам 1884. године, који је успео да класификује бактерије у Грам позитивне и Грам негативне, према саставу ћелијског зида..

Техника је подвргнута извесним модификацијама Хакера 1921. године да би се стабилизовали реагенси и побољшао квалитет мрље, тако да је Грам боја позната и као Грам-Хуцкер.

Овом техником могуће је посматрати и облик који микроорганизми имају, односно да ли су то коки, бацили, кокобацили, плеоморфни, филаментозни. Као и његова дистрибуција у простору: у кластеру, у ланцу, изолованом, у паровима, у тетрадама, итд..

Када се посумња на бактеријску инфекцију, већина добијених узорака треба да се стави на слајд и обоји Грамом за преглед под микроскопом..

Извештај о Граму ће водити доктора о томе који тип микроорганизма може бити узрок инфекције, пре добијања коначног резултата усева.

У неким случајевима живот пацијента је веома компромитован, тако да лекарима хитно треба Грам извештај да би се емпиријски третман, док чекају идентификацију микроорганизма..

На пример, ако Грам открије да постоје Грам позитивни кокови у цереброспиналној течности, доктор ће оријентисати почетну терапију антибиотицима који елиминишу овај тип бактерија, према протоколима који су за њега успостављени..

Када стигне коначни резултат са именом изолованог микроорганизма и његовим одговарајућим антибиограмом, лекар ће проценити да ли да промени терапију или не. Ова одлука ће бити донета у складу са проучавањем осетљивости микроорганизма на антибиотике које прима и еволуцију пацијента..

Индек

• 1 Фоундатион
• 2 Материјали
• 3 Припрема бојила и реагенса
  • 3.1 Раствор кристално љубичастог
  • 3.2 Иодо-Лугол
  • 3.3 Избељивање
  • 3.4 Контраст
• 4 Складиштење реагенса
• 5 Припрема ширења узорка за бојење
  • 5.1-грам директних узорака
  • 5.2-Грам усева
• 6 Техника
• 7 Утилити
• 8 Уобичајене грешке
• 9 Референце

Фоундатион

То је техника која представља 4 фундаментална корака: бојење, фиксирање са трунком, дисколорација и контрактикација. Стога их ова техника, поред бојења бактерија, разликује и од њих.

Кристал љубичица је прва боја која се користи. Има афинитет за пептидогликан и љубичасту боју свих присутних бактерија, затим се поставља лугол, који делује као мордант, односно, изазива формирање нерастворних комплекса кристал виолет-јод - рибонуклеарни протеини унутар ћелије.

Грам-позитивне бактерије, које имају дебели зид пептидогликана, формирају више комплекса (кристално виолет-јод), стога задржавају боју.

Такође утиче да грам-позитивни бактеријски зид садржи већу количину незасићених киселина, које показују висок афинитет за оксидациона средства (Лугол).

У међувремену, Грам-негативне бактерије имају танак слој пептидогликана, који чини бактерије мање комплексним од грам-позитивних бактерија.

Затим долази корак губитка боје, где се Грам позитивне и Грам негативне бактерије понашају другачије.

Грам негативне бактерије садрже спољашњу мембрану богату липополисахаридима који су део његове ћелијске стијенке. Масти се уништавају контактом са алкохолом ацетоном, тако да се спољашња мембрана дестабилизује, кристал љубичице се ослобађа.

На тај начин се онда обоји сафранином или основним фуксином, узимајући црвену боју.

У случају Грам-позитивних бактерија, оне се опиру дисколорацији јер бјелило дјелује тако да затвара поре, што спречава да кристални виолет / јодни комплекс побегне.

Према томе, бојење са кристалом љубичице је стабилно и нема места за сафранин или фуксин. Због тога ове бактерије мрље интензивно плаве или љубичасте.

Материјали

Грам сет боја садржи:

• Виолет цристал
• Лугол
• Ацетоне алцохол
• Сафранин или основни фуксин

Припрема боја и реагенса

Раствор кристално љубичастог

Решење А:

Виолет цристал -2 гр

Етил алкохол 95% -20цц

Решење Б:

Амонијум оксалат -0,8 гр

Дестилирана вода-80 цм3

За коначну припрему кристала љубичице, 1:10 раствор треба разриједити дестилираном водом и помијешати са 4 дијела отопине ​​Б. Смјеса се чува 24 сата прије употребе. Филтрира се у боци за бојење јантара користећи папирни филтер.

Количина која ће се свакодневно користити пребацује се у амбер боцу са капаљком.

Иодо-Лугол

Измерити и измерити назначену количину сваког једињења, као што следи:

Кристали јода - 1гр

Калијум-јодид - 2гр

Дестилирана вода -300 цм3

Калијум јодид се раствара мало по мало у води и затим се додаје јод. Отопина је обријана на боце јантарне боје.

Количина која ће се свакодневно користити преноси се у мању ћилибарску боцу са капаљком.

Блеацхинг

95% етил алкохол -50 мл

Ацетон - 50 мл

Припрема се у једнаким дијеловима. Добро покријте, тежи да испари.

Ставите у боцу са капаљком.

Овај препарат обезбјеђује дисколорацију у умереном времену од 5-10 секунди и највише се препоручује.

Почетници преферирају да користе само 95% етил алкохола, гдје је промјена боје спорија од 10 до 30 секунди.

Док најискуснији могу користити чисти ацетон, где се промена боје дешава веома брзо од 1 до 5 секунди.

Контраст

Сафранин стоцк решење

Сафранина -2.5 гр

Етил алкохол 95% -100 цм3

Након вагања, назначена количина сафранина се раствара у 100 цм3 етилног алкохола до 95%.

Радни раствор сафранина се припрема из почетног раствора.

Да би се то урадило, измерити 10 цм3 основног раствора, додати 90 цм3 дестиловане воде да се заврши 100 мл.

Препоручује се да се количина која се свакодневно користи пребаци у амбер боцу са капаљком.

Микроорганизми који слабо осликавају Грам негативно са Грам-Хуцкер бојом, као што су одређени анаероби, Легионелла сп, Цампилобацтер сп и Бруцелла сп, могу бити много боље обојени ако се користи модификација коју је Копелофф направио за Грам-Хуцкер бојење, назван Грам-Копелофф мрља, користи се.

Ова техника мења боју сафранина базичним фуксином. Са овом модификацијом могуће је ефикасно обојити горе поменуте микроорганизме.

Складиштење реагенса

Припремљене боје треба чувати на собној температури.

Припрема узорка се шири на боју

Узорак мора садржати најмање 10⁵ микроорганизама пре посматрања микроорганизма у размазу. Намази се могу направити од директног узорка или култура у чврстим или течним медијима.

Намази би требали бити једнолични, добро распоређени и не предебели, за бољу визуализацију присутних структура.

-Грам директних узорака

Грам урина без центрифуге

Урин је мешан и 10 μл је стављено на слајд. Посматрање најмање једног поља бактерије / урањања показује да постоји инфекција.

То значи да ће култура имати приближно више од 100.000 ЦФУ / мл (10⁵ ЦФУ / мЛ) урина у 85% случајева.

Овај метод није користан за бројање колонија испод 100,000 ЦФУ.

ЛЦР Грам

ЦСФ би требало центрифугирати, супернатант уклонити и пелет ширити на слајд. Ова течност је стерилна под нормалним условима; посматрање бактерија указује на инфекцију.

Грам респираторних узорака

Грам за спутум, бронхијални или бронхоалвеоларни лаваж, иако може постојати низ микроорганизама, увек ће водити у дијагнози, поред тога што је корисна врста посматраних ћелија.

У случају испљувка, размаз треба припремити са највише гнојним деловима узорка.

Стоол Грам

Није препоручљиво изводити Грам за ову врсту узорака, јер нема дијагностичку вриједност.

-Грамне културе

Оне се могу обавити на два начина, један од течних усјева, а други из чврстих усева.

Ликуид цропс

Из течних култура је крајње једноставно; под упаљачем се узима неколико печења мутног бујона и оне се стављају на чист и сух слајд, пружајући кружне покрете од центра ка периферији, да би се материјал равномерно распоредио.

Пусти се да се спонтано осуши у ваздуху. Када се осуши, материјал се причвршћује на плахту топлотом. За то, уз помоћ стезаљке, лист 3 се 4 пута пропушта кроз пламен Бунсен пламеника, водећи рачуна да се материјал не запали..

Плоча се остави да се охлади и стави на мост за бојење.

Солид цропс

Да бисте извршили проширење за Грам боју из чврсте културе, поступите на следећи начин:

Пре одабира колонија које треба узети, слајд треба да се припреми, стављањем две капи приближно стерилног физиолошког раствора.

Ако оригинална плоча културе садржи неколико различитих типова колонија, изолована колонија сваког од њих ће бити изабрана да изврши Грам. Свака колонија ће се узети са платинастом петљом како би се растворила у раствору који је претходно стављен на слајд.

Кружни покрети су дати од центра ка периферији, да би се колонија хомогено распоредила на слајду..

Пусти се да се спонтано осуши у ваздуху. Када се посуши, плоча се фиксира топлотом, као што је горе објашњено (пламени клизач са упаљачем), пазећи да не запали материјал.

Ова процедура се мора обавити са сваком врстом колоније. На комаду папира треба навести редослед опажених, на пример:

Колонија 1: Жута бета-хемолитичка колонија: Грам-позитивни коки су примећени у кластерима

Колонија 2: Кремна колонија, без хемолизе: примећени су грам негативни кокобацили.

Сваки лист мора бити означен тако да зна шта посматрамо.

Техника

Техника бојења по Граму је изузетно једноставна за извођење и релативно јефтина и не може се пропустити у микробиолошкој лабораторији.

Исто се ради на следећи начин:

1. Поправите размаз топлином и ставите га на обојени мост.
2. Лист је потпуно покривен љубичастим стаклом 1 минут.
3. Исперите водом. Не суши се
4. Покријте плочу отопином Лугола, оставите 1 минут. Исперите водом. Не суши се.
5. Мешати 5-10 секунди уз лагано мешање у ацетон алкохолу. Или поставите лим у усправан положај и испустите капљице средства за обезбојење на површину док се преостало љубичасто стакло не повуче. Не прелазите.
6. Исперите водом. Не суши се.
7. Замените лим на обојеном мосту и покријте 30 сец са сафранином (Грам-Хуцкер) или 1 мин са основним фуксином (Грам-Копелофф).
8. Исперите водом
9. Пустите да се спонтано осуши у ваздуху.

Када се осуши, ставите 1 кап уља за урањање да га посматрате под циљем од 100Кс у оптичком микроскопу.

Утилити

Ова техника омогућава да се разликују морфотипентијске разлике код већине бактерија.

Овакву боју одликују и квасци. Узимају кристално љубичасту, тј. Мрље су позитивне.

С друге стране, могу се разликовати грам-позитивне споре-формирајуће бациле, у којима се види јасан простор унутар бацила, гдје је формирана ендоспора, иако споре не мрље добро. Да би се користиле споре, користе се друге технике као што је Схаеффер-Фултон.

Треба напоменути да ова мрља не служи за бојење свих врста бактерија, то јест, постоје случајеви у којима бојење не делује.

У овом случају могу се споменути бактерије које немају ћелијски зид. На пример: род Мицопласма, сферопласти, Уреапласма, Л-облици и протопласти.

Исто тако јако прља бактерије са зидовима богатим миколичким киселинама, као што су микобактерије и интрацелуларне бактерије као што су Цхламидиас и Рицкеттсиас.

Такође је неефикасно да се боји већина спирохеталних бактерија.

Постоје бактерије истог рода које се могу посматрати у истом узорку као Грам позитивне и као Грам негативне. Када се то догоди, назива се варијабилна Грам боја, која може бити узрокована промјеном храњивих твари, температуром, пХ или концентрацијом електролита..

Уобичајене грешке

Избељите претјерано

Претеривање у кораку дисколорације може проузроковати посматрање лажних грам-негативних микроорганизама.

Немојте чекати довољно времена за сушење да бисте додали уље за урањање:

Ова грешка узрокује стварање масних мицела које отежавају посматрање присутних структура. То се дешава када уље споји молекуле воде присутне у размази.

Обрните редослед реагенса:

Грешка попут ове ће узроковати да Грам-негативне бактерије прикажу љубичасту, односно лажну Грам-позитивну.

Користити старе усеве (чврсте или течне):

Може проузроковати да Грам позитивне бактерије ставе Грам негативан (лажни Грам негативан). То се дешава зато што је у старим културама вероватно да постоје мртве или погоршане бактерије и под овим условима бактерије не задржавају кристал љубичице.

Користите веома старо Лугол решење:

Временом лугол губи своја својства и боја блиједи. Ако се користи већ дегенерисани реагенс, он неће добро фиксирати кристално љубичасту бушотину, тако да постоји могућност добијања визуелизације микроорганизама лажно негативног по Граму негативном..

Блуисх бацкгроунд

Позадина правилно обојена ће бити црвена. Плава позадина показује да је обезбојење било недовољно.

Референце

1. Риан КЈ, Раи Ц. 2010. Схеррис. Микробиологија Медицал, 6. издање МцГрав-Хилл, Нев Иорк, САД
2. Конеман Е, Аллен С, Јанда В, Сцхрецкенбергер П, Винн В. (2004). Микробиолошка дијагноза. (5. изд.). Аргентина, Уводник Панамерицана С.А..
3. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А. 2009. Микробиолошка дијагностика Баилеи & Сцотт. 12 ед. Аргентина Панамерицана С.А Уводник
4. Цасас-Ринцон Г. 1994. Генерал Мицологи. 2. издање Универсидад Централ де Венезуела, издања библиотеке. Венецуела, Царацас.
5. "Грам боја" Википедиа, Тхе фрее енцицлопедиа. Окт 4 2018, 23:40 УТЦ. 9 Дец 2018, 17:11. Преузето са ес.википедиа.орг.
6. Гонзалез М, Гонзалез Н. 2011. Мануал оф Медицал Мицробиологи. 2. издање, Венецуела: Дирекција за медије и публикације Универзитета Царабобо.
7. Лопез-Јацоме Л, Хернандез-Дуран М, Цолин-Цастро Ц, Ортега-Пена С, Церон-Гонзалез Г, Франко-Цендејас Ф. Основно обојење у микробиолошкој лабораторији. Истраживање о инвалидности. 2014; 3 (1): 10-18.