Темељ, технике и употреба за бојење спора

Тхе бојење спора је методологија која се користи за бојење отпорних структура које формирају неке бактеријске родове када су у неповољним условима; ове структуре одговарају начину опстанка.

Постоје многе врсте које формирају споре; међутим, главни су Бациллус и Цлостридиум. Ови родови се сматрају релевантнијим јер имају патогене врсте за људе.

Сваки бацил може да изазове споре. У време бојења препарата, спора се може наћи унутар бацила (ендоспоре) или изван њега (егзоспоре). Са конвенционалним техникама бојења за бактерије - као што је Грам боја - споре остају безбојне.

Тренутно, постоји неколико методологија бојања које су у стању да пређу дебелу структуру спора да би се обојиле. Ове методологије су веома различите; међу њима можемо споменути Дорнерову технику, Моеллер-ову мрљу и Схаеффер-Фултонову методологију, такођер познату као Виртз-Цонклин..

Од свих наведених техника, Схаеффер-Фултон методологија се највише користи у рутинским лабораторијама. Име му дугује два микробиолога који су 1930. године створили боју: Алициа Схаеффер и МацДоналд Фултон. Међутим, понекад се техника зове Виртз-Цонклин у част два бактериолога из 1900-их.

Индек

• 1 Фоундатион
• 2 Технике бојења спора
  • 2.1 Дорнерова техника
  • 2.2 Модификована Дорнерова техника
  • 2.3 Техника Схаеффер-Фултон или Виртз-Цонклин
  • 2.4 Моеллер техника
  • 2.5 Модификована Моеллер техника без топлоте
• 3 Усес
  • 3.1 Примери
• 4 Референце

Фоундатион

Споре не мрље конвенционалним бојама јер имају веома дебели зид. Сложен састав спора спречава улазак већине боја.

Ако се споре проучавају споља према унутра, посматрају се следећи слојеви: прво, егзоспориум, који је најтањи спољашњи слој формиран од гликопротеина..

Затим долази кутикула, која пружа отпорност на високе температуре, након чега слиједи кортекс састављен од пептидогликана. Затим се налази зид базе који штити протопласт.

Спора је дехидрирана структура која садржи 15% калцијума и дипиколинске киселине. Због тога се већина техника споре боје заснива на примени топлоте тако да боја може да продре у дебелу структуру.

Када је спора обојена, она не може елиминисати боју. У Схаеффер-Фултон техници, малахитно зелено улази у вегетативне ћелије и, након примене топлоте, продире у ендоспору и такође у егзоспоре.

Када се пере са водом, боја се уклања из вегетативне ћелије. Ово се дешава зато што је зелена малахитна боја благо базична, па се слабо веже за вегетативну ћелију.

С друге стране, не може изаћи из споре и коначно контрастирати бацил са сафранином. Ова основа важи за остале технике, у којима се догађа нешто слично.

Технике бојења спора

Да би споре биле мрље, морате имати чисту културу сумњивог соја који желите да проучавате.

Култура је подвргнута екстремним температурама током 24 сата да би се микроорганизам стимулисао на спорулацију. За то, култура се може ставити у рерну на 44 ° Ц или у фрижидер (8 ° Ц) 24 или 48 сати.

Ако се на поменутим температурама остави превише времена, посматраће се само егзоспоре, јер ће све ендоспоре напустити бацил.

На крају времена, неколико капи стерилног физиолошког раствора треба ставити на чисту плочицу. Затим се узима мали део усева и прави се фини намаз. 

Након тога се оставља да се осуши, фиксира се на топлоту и замрља се неким од техника које су објашњене у наставку:

Дорнерова техника

1- Припремите у епрувети концентровану суспензију спорулираног микроорганизма у дестилованој води и додајте једнаку запремину филтрираног Киниоун фенолног фуксина.

2. Ставите епрувету у каду са кипућом водом 5 до 10 минута.

3 - На чистом клизнику, мешати кап претходне суспензије са капљицом 10% воденог раствора нигрозина, прокуваном и филтрираном..

4. Продужите и осушите брзо са благом топлотом.

5- Испитати са 100Кс објективом (урањање).

Споре црвене боје и бактеријске ћелије изгледају готово безбојне на тамно сивој подлози.

Модификована Дорнер техника

1- Суспензија спорулираног микроорганизма се шири на клизач и фиксира на топлоту.

2 - Узорак је покривен траком филтер папира у коју је додана фуксин фенске киселине. Боја се загрева 5 до 7 минута са пламеном Бунсен пламеника док се не ослободи испарење. Тада је папир уклоњен.

3. Оперите препарат водом и осушите упијајућим папиром.

4- Покријте размаз танким филмом од 10% нигросина, користећи други клизач за ширење нигросина или игле.

Обојеност спора и бактерија је иста као и она описана у претходном стању технике.

Схаеффер-Фултон или Виртз-Цонклин техника

1- На танком слоју направите танку посуду са суспензијом микроорганизма који је спорулиран и причврстите је на топлоту.

2 - Покријте клизач воденим раствором од 5% малахит зеленог (филтер папир се може поставити на листу).

3 - Загријте на пламену Бунсен пламеника како бисте избацили пару и уклонили пламен. Поновите поступак 6 до 10 минута. Ако се током поступка превише раствори малахитно зелени раствор, може се додати још.

4- Уклоните филтер папир (ако је постављен) и оперите га водом.

5. Покријте слајд са 0.5% воденим сафранином у трајању од 30 секунди (неке варијанте технике користе 0.1% воденог сафранина и оставите га 3 минута).

Овом техником споре су зелене, а бацили црвене боје.

Недостатак је што ендоспоре младих култура не мрље добро, јер изгледају изузетно бистро или безбојно. Да би се то избегло, препоручује се употреба култура од 48 сати инкубације.

Моеллер тецхникуе

1- Покријте размаз хлороформом 2 минута.

2. Одбаците хлороформ.

3- Покријте 5% хромном киселином 5 минута.

4. Исперите дестилованом водом

5 - Плоча је прекривена фуцхсин-фенолним шараном и изложена пламену Бунсен пламеника до емисије пара; затим се уклања из пламена неколико тренутака. Операција се понавља док не достигне 10 минута.

6. Оперите водом.

7. Користите закисељени етанол (хлороводонични алкохол) за обезбојење. Оставља се 20 или 30 секунди.

8 Исперите дестилованом водом.

9- Контрактирајте покривање плоче метиленским плавим током 5 минута.

10 Исперите дестилованом водом.

11- Остави се да се осуши и узорак се узме под микроскопом.

Споре изгледају црвено и плаво. Важно је не удисати паре, јер су токсичне и дугорочно могу бити канцерогене.

Модификована Моеллер техника без топлоте

Хаиама и његови сарадници су 2007. године направили модификацију Моеллер технике. Уклонили су корак загревања боје и заменили га додатком 2 капи површински активног средства Тергитол 7 на сваких 10 мл раствора фуксина-фенолног карболика. Добијени су исти резултати.

Усес

Бојање спора даје веома драгоцену и корисну информацију за идентификацију патогена, јер присуство истог, његов облик, локација унутар бацила и способност да се деформише вегетативна ћелија или не, су подаци који могу водити врсту укључени у одређени род.

У том контексту, вреди поменути да споре могу бити округле или овалне, могу се налазити у центру или у парацентралном, субтерминалном или терминалном положају..

Примери

- Цлостридиум диффициле формира овалну спору у терминалном положају која деформише бацил.

- Споре Цлостридиум тертиум Она је овална, не деформише бацил и налази се на терминалном нивоу.

- Ендоспоре од Цлостридиум тетани она је терминална и деформише бацил, што даје изглед палице.

- Споре Цлостридиум ботулинум, Ц. хистолитицум, Ц. нови и Ц. септицум они су округли или субтерминални овални и деформишу бацил.

- Ендоспоре од Цлостридиум сорделли Налази се у централном положају, са малом деформацијом.

Референце

1. Хаиама М, Оана К, Козакаи Т, Умеда С, Фујимото Ј, Ота Х, Каваками И. Приједлог поједностављене технике за бојење бактеријских спора без примјене топлотно успјешне модификације Моеллерове методе. Еур Ј Мед Рес. 16 (8): 356-9.
2. Википедиа цонтрибуторс. Моеллер стаин. Википедиа, Тхе Фрее Енцицлопедиа. 3. новембар, 2018, 03:28 УТЦ. Доступно на: ен.википедиа.орг
3. Перез Р, Јуарез М, Родригуез (2011). Лабораторијски приручник за микробиолошке технике. Одсјек за основне знаности Академије микробиологије. Национални политехнички институт.
4. "Ендоспора." Википедиа, Тхе фрее енцицлопедиа. Феб 25 2018, 10:20 УТЦ. 10 Јан 2019, 02:42: ен.википедиа.орг
5. Силва Л, Силва Ц, Фернандез Н, Буено Ц, Торрес Ј, Рицо М, Мациас Ј и сарадници. (2006). Радно особље Аутономне заједнице Екстремадура. Специфични програм Том ИВ. Едиториал МАД. Севилле-Спаин, стр. 211-212.
6. Силва М, Гарциа М, Цорралес Ј, Понце Е. (2006), специјалистички лабораторијски техничар Галицијске здравствене службе (СЕРГАС). Предмет специфичан волумен 2. Уводник МАД. Севилле-Спаин, стр. 79-80.
7. Конеман Е, Аллен С, Јанда В, Сцхрецкенбергер П, Винн В. (2004). Микробиолошка дијагноза. (5. изд.). Аргентина, Уводник Панамерицана С.А..
8. Форбес Б, Сахм Д, Веиссфелд А. 2009. Микробиолошка дијагностика Баилеи & Сцотт. 12 ед. Аргентина Панамерицана С.А Уводник