Секвенцирање ДНК Макам-Гилберт, Сангер метода, примери



Тхе ДНА секуенцинг (деоксирибонуклеинска киселина) је поступак који се изводи у лабораторијама молекуларне биологије који омогућава познавање редослиједа нуклеотида у генетском материјалу који је од интереса. Поред тога, може се открити и секвенцирање РНК (рибонуклеинске киселине).

Ова техника је неопходна за развој биолошких наука. Примјењује се и на друга подручја знања - као што су медицинска дијагноза и форензичка истраживања, на примјер.

Раније је секвенцирање ланца ДНК сматрано спором и скупом активношћу, што је омогућило идентификацију само неколико парова база у олигонуклеотидима.

Данас, са свим достигнућима науке, ДНК секвенцирање је рутинска операција у многим лабораторијама широм света захваљујући доприносу од скоро 50 година истраживања у овој области. Што се тиче дужине ланца, можете да секвенцирате до милион парова база у врло кратком времену.

Да би се то постигло, развијено је на десетине техника које се разликују по цени и прецизности. У овом чланку ћемо описати и класичне и модерне технике, од којих свака има своје предности и недостатке.

До сада, технике секвенцирања омогућавају да се добије секвенца комплетних генома, од малих прокариота и квасаца до хуманог генома..

Индек

  • 1 Структура ДНК
  • 2 Хистори
  • 3 Сангер метода
    • 3.1 Главне компоненте реакције
    • 3.2 Читање резултата
  • 4 Аутоматско секвенцирање
  • 5 Макам-Гилберт секвенцирање
    • 5.1 Поступак
    • 5.2 Читање резултата
  • 6 Масивно секвенцирање
    • 6.1
    • 6.2 Секвенцирање путем синтезе
    • 6.3 Редослед везивања
    • 6.4 Редослед Ион Торрент
  • 7 Примери
    • 7.1 Секвенцирање хуманог генома
  • 8 Важност и примјене
  • 9 Референце

Структура ДНК

Да би се разумеле методе и технике које се користе за секвенцирање ДНК, неопходно је знати одређене кључне аспекте структуре и састава молекула..

ДНК је биомолекула која се налази у свим живим бићима, од бактерија до великих водених животиња. Органеле - попут митохондрија и хлоропласта - имају кружни молекул ДНК унутар њих. Чак и код неких вируса, пронађени генетски материјал је ДНК.

Структурно, ДНК је скуп нуклеотида. Свака је интегрисана угљеним хидратима, азотном базом (А, Т, Ц или Г) и групом фосфата. Циљ секвенцирања ДНК је открити редослед у којем се налазе четири азотне базе у низу.

Хистори

Средином педесетих, истраживачи Ватсон и Црицк су описали структуру ДНК користећи кристолошке технике. Међутим, ниједан од ових истраживача није успио пронаћи начин да открије секвенцу.

Иако су постојали одређени претходници, најважнији догађај био је стварање Сангер-овог метода, 1977. Фредерицк Сангер, отац методе, био је британски биокемичар, добитник двије Нобелове награде за огромне доприносе биолошким наукама..

Ова техника је такође позната у литератури као "завршетак ланца" или дидеоксинуклеотиди. Затим ћемо описати принципе ове технике и оне које су развијене на основу побољшања и иновације.

Сангер-ова метода

Развој Сангер-ове методе представљао је кључни догађај у молекуларној биологији. Укључује основне компоненте процеса репликације ДНК које се нормално дешавају у ћелији, али додавањем посебне компоненте: дидеоксинуклеотиди.

Главне компоненте реакције

- ДНК полимераза: ензим ДНК полимераза је кључни елемент процеса. Овај молекул учествује у репликацији ДНК ланца и његова улога је синтеза новог ланца, који одговара деоксирибонуклеотидима трифосфата са комплементарним.

Запамтите да су у ДНК тимин (Т) упарени са аденинима (А) помоћу две водоничне везе, док цитозин (Ц) ради са гванином (Г) са три моста.

- Нуклеотиди: Сангер секвенцирање укључује два типа нуклеотида, четири 2'-деоксинуклеотида (скраћено дАТП, дГТП, дЦТП и дТТП) и четири дидеоксинуклеотида (ддАТП, ддГТП, ддЦТП и ддТТП).

Иако су дидеоксинуклеотиди слични мономерима који су нормално инкорпорирани у ДНК, недостаје им -ОХ група у својој структури. Због тога је немогуће додати нови нуклеотид у ланац.

Стога, када се додаје посебан нуклеотид - на потпуно случајан начин - у ланац у формацији, синтеза је парализована. На овај начин, на крају реакције, постоје ланци различитих величина, где је реакција заустављена на различитој тачки..

Експериментално, припремљена су четири испитивања. Свака садржи ДНК екстрахирану из биолошког узорка од интереса, нормалне нуклеотиде и један од четири типа специјалних нуклеотида. Или су посебни нуклеотиди означени неким типом флуоресцентног маркера (види ниже аутоматизовано секвенцирање).

Читање резултата

Први корак је раздвајање сваког од синтетизираних ланаца у складу са њиховом величином. Неки ће бити дужи од других, у зависности од тога где су специјалне базе укључене.

Постоје различите биохемијске технике које омогућавају раздвајање компоненти смеше употребом величине као дискриминаторне својине. У Сангер методи, различити ланци се раздвајају електрофорезом. У најсофистициранијим варијантама технике користи се капиларна електрофореза.

Дакле, дужи праменови се крећу мање од краћих варијанти. Затим, овај систем пролази кроз читач који препознаје маркер укључен у сваки дидеоксинуклеотид. На овај начин, редослед секвенци може бити познат.

Ова техника "прве генерације" може да чита фрагменте ДНК не веће од 1 килобаза. У овом тренутку, Сангер-ова метода се користи у неколико лабораторија, углавном у модерним варијантама. Поред тога, користи се за потврђивање резултата добијених најсложенијим техникама - али мање прецизним.

Аутоматско секвенцирање

Када је потребно редослед великих размера, процес се убрзава аутоматизацијом. Ово је варијанта Сангер-овог метода завршетка ланца, где су прајмери ​​обележени флуоресцентним производима да би их се разликовало.

Након тога, производ реакције се изводи у електрофорези - све у једној траци. Када сваки фрагмент напусти коначни део гела, брзо се идентификује својом флуоресцентном етикетом, са грешком која окружује 1%.

Најсофистициранији системи имају систем од до 96 капиларних цеви којима управља компјутер повезан са роботом. То јест, 96 узорака ДНК се може проценити истовремено. Дакле, процес који укључује електрофорезу и анализу резултата је потпуно аутоматизован.

У једном дану, ови системи могу секвенцирати до 550.000 база. Током процеса, људски рад је непотребан, потребно је само 15 минута да се започне са методом.

Секвенцирање Макам-Гилберта

У исто време када је Сангер објавио свој рад, два истраживача по имену Аллан Макан и Валтер Гилберт успели су да развију други метод за добијање ДНК секвенце. Метода је добила популарност у то време, али је касније измењена побољшањем Сангер-овог метода.

Супротно Сангер-овом методу, секвенцирање Макана и Гилберта (или хемијско секвенцирање, као што је познато) не укључује хибридизацијске реакције. Методологија се састоји од означавања реактивним средствима на једном крају, након чега слиједи процес прочишћавања.

Један од негативних аспеката ове технике лежи у њеној огромној сложености и употреби хемикалија које су опасне за корисника. Хемијске разградње се индукују применом ДМС, мравље киселине, хидразина и хидразина са солима.

Процедура

Протокол започиње означавањем на 5 'крају траке са фосфорним маркером 32, затим долази до хемијске модификације азотне базе и она се раздваја. На крају долази до раздвајања абасичног подручја.

Прво се ланац који треба секвенцирати скраћује на мање сегменте. Овај корак се изводи са рестрикционим ензимима, који резултирају изванредним екстремима.

Затим се реакција изводи са алкалном фосфатазом, чија је сврха да елиминише фосфатну групу. Према томе, полинуклеотидна киназа се може користити за обављање обележавања.

Ланац је денатуриран (два ланца отворена). Онда настављамо са применом хемикалија. Ове реакције цепања се врше на контролисан начин и које врсте веза се прекидају применом сваке хемикалије.

Читање резултата

Као и код Сангер методе, очитавање резултата укључује раздвајање ланаца добијених у систему електрофорезе. Системи састављени од полиакриламида омогућавају добијање веома адекватне резолуције за читање гела.

Масивно секвенцирање

Масовно секвенцирање обухвата низ нових метода, скраћено као НГС, са енглеског "Секвенца следеће генерације ".

Методе каталогизоване као НГС захтевају претходни корак амплификације ДНК (не раде са једним молекулом). Поред тога, коришћене платформе су веома различите. Принципи најпопуларнијих метода биће описани у наставку:

Пиросекуенцинг

То укључује праћење ослобађања пирофосфата, који се јавља сваки пут када се нови нуклеотид дода у ланац ДНК. Ензимски систем је повезан, тако да се емисија светлости (која се детектује помоћу камере) јавља сваки пут када се угради нови нуклеотид.

Процес почиње одвојеном инкубацијом сваке азотне базе да би се проверило да ли постоји или не емитује светлост. Пиросекуенцинг може обавити читање дугих ланаца, али је пронађена стопа грешке висока.

Секвенцирање синтезом

Ово укључује инкорпорацију обележених нуклеотида. Ове флуоресцентне компоненте се додају, исперу и уочава се инкорпорирани нуклеотид. Затим, нуклеотидно обележавање је елиминисано и синтеза ланца се може наставити. У следећем кораку ће такође бити инкорпориран обележени нуклеотид, и поменути кораци ће се поновити.

Један недостатак ове технике се јавља када флуоресцентни маркери нису потпуно елиминисани. Ове емисије стварају позадинске грешке, што резултира значајним грешкама.

Редослед везивањем

Ова техника варира од других, јер не користи ДНК полимеразу. Уместо тога, кључни ензим за ову методологију је лигаза. Овде се користе фрагменти ДНК флуоресцентно обележени, везани су ензимом и детектовани.

Највећи проблем ове технике је веома кратка дужина фрагмента који је способан за обраду.

Ион Секуенцинг Торрент

Ова техника се заснива на мерењу Х јона+ који се ослобађа сваки пут када се угради нови нуклеотид. Принцип је прилично сличан пиросеквенцији, али много јефтинији.

Примери

Секвенцирање људског генома

Секвенцирање генома људи је био један од најперспективнијих изазова у биологији, као и један од најцјењенијих ривалстава у историји науке. У ствари, за научнике укључене у пројекат, секвенцирање генома је постало конкуренција.

Године 1990. покренуо је такозвани "пројект људског генома", који је водио познати научник, добитник Нобелове награде, Јамес Ватсон. После годину дана, 1991, Вентер преузима изазов "пребијања" Ватсона и секвенцирање генома пре њега. Међутим, 1992. године, Ватсон се повукао и команду је преузео други истраживач.

Године 1995. Вентер је најавио свој успјех у комплетном секвенцирању бактеријског генома методом случајног секвенцирања. Слично томе, супротни тим је годину дана касније објавио секвенцирање генома квасца.

У 2000. години раса је прекинута. Обе компаније су објавиле прелиминарне резултате комплетног генома у два најпрестижнија научна часописа: Природа и Сциенце.

Међутим, научници су наставили да раде на побољшању предлога, а 2006. године секвенце су завршене одређеним људским хромозомима.

Значај и апликације

Познавање редоследа нуклеотида молекула једнако важно као и ДНК је драгоцено за биологе и сродне стручњаке. Овај ланац полинуклеотида садржи све информације потребне за развој и одржавање свих облика живота.

Из ових разлога, познавање ове секвенце је неопходно за биолошка истраживања. У основи, секвенцирање нам омогућава да измеримо једну од најважнијих особина биолошких система и да утврдимо разлике између њих.

Секвенцирање је широко коришћено од стране таксономиста и систематиста, јер одређени ДНК секвенци омогућавају утврђивање критеријума за закључак да ли два организма припадају истој врсти или не, као и да могу предложити хипотезе о филогенетским односима између њих..

Поред тога, секвенцирање ДНК има примену у области медицине и дијагностике. На пример, постоје приступачни и приступачни системи који нам, кроз секвенцирање, дозвољавају да проценимо тенденцију развоја одређених болести (као што је рак) користећи такозване једноставне нуклеотидне полиморфизме (СНП)..

Истраге криминалистичког и форензичког типа су такође обогаћене техникама секвенцирања и могу се користити као поуздани докази о учешћу одређеног појединца у злочину..

Референце

  1. Хеатхер, Ј. М., & Цхаин, Б. (2016). Секвенца секвенцера: историја секвенционирања ДНК. Геномика, 107(1), 1-8.
  2. Коболдт, Д.Ц., Стеинберг, К.М., Ларсон, Д.Е., Вилсон, Р.К., & Мардис, Е.Р. (2013). Следећа генерација револуције секвенцирања и њен утицај на геномику. Целл, 155(1), 27-38.
  3. Леви, Ј. (2010). Научна ривалства. Од Галилеа до пројекта људског генома. Паранинфо Едиториал.
  4. Сангер, Ф., Ницклен, С., & Цоулсон, А.Р. (1977). Секвенцирање ДНК са инхибиторима који завршавају ланцем. Зборник радова Националне академије наука, 74(12), 5463-5467.
  5. Сцхустер, С.Ц. (2007). Секвенцирање следеће генерације трансформише данашњу биологију. Природне методе, 5(1), 16.
  6. Ксу, Ј. (ур.). (2014). Секвенцирање следеће генерације. Цаистер Ацадемиц Пресс.