Карактеристике протеиназе К, ензимска активност и апликације



Тхе протеинасе К је ензим који припада групи серинских протеаза, то јест, има у свом активном каталитичком центру аминокиселински серин и има функцију разбијања пептидних веза хидролизом. Заузврат, овај ензим припада породици протеина субтилизина (пептидаза С8).

Протеиназа К има молекулску масу (МВ) од 28.900 далтона и први пут је изолована 1974. године од екстракта гљивица Енгиодонтиум албум, раније познат под именом Тритирацхиум албум Лимбер.

Представља високи протеолитички капацитет, доказано да је у стању да разгради кератин присутан у коси. Реч кератин на енглеском језику је написана "кератин", па је названа "протеиназа К".

Због свог високог капацитета за цијепање природних протеина, овај ензим је користан у различитим техникама молекуларне биологије. Углавном се користи за изолацију и припрему нуклеинских киселина са високом молекулском масом (МВ).

Протеиназа К делује тако што ослобађа нуклеарну ДНК, док уништава протеине и инактивира РНазе и ДНазе, тј. Елиминише нуклеазе у ДНК и РНА препаратима..

С друге стране, уочено је да протеиназа К може хидролизовати неке денатуриране природне протеине, што је изазвало интересовање истраживача за његову употребу у проучавању прионских протеина (ПрПЦ)..

Међутим, упркос његовој високој протеолитичкој моћи постоје протеини који су отпорни на дејство протеиназе К. Међу њима, постоје неки абнормални протеини који се називају приони (ПрПСц), повезани са трансмисивним спонгиформним енцефалопатијама..

Индек

  • 1 Карактеристике протеиназе К
  • 2 Ензиматска активност
  • 3 Апплицатионс
  • 4 Предности протеиназе К
  • Протеини отпорни на протеине К
  • 6 Референце

Карактеристике протеиназе К

Протеиназа К има терцијарну структуру формирану од три слоја, са β лимом од седам ланаца распоређених између два слоја спирале. Пошто припада породици С8 пептидаза, карактерише га каталитичка тријада у свом активном месту, чији је редослед редом (Асп, Хис и Сер), што их разликује од других породица пептидаза..

Овај ензим из групе серинских протеаза се карактерише хидролизом пептидних веза близу карбоксилне групе алифатских и ароматичних амино киселина.

С друге стране, он је способан да делује у присуству одређених корозивних супстанци, као што су натријум додецил сулфат (СДС), Трис-ХЦЛ и ЕДТА, које се користе да помогну денатурацији протеина, узрокујући да изгубе своју природну структуру..

Ово је прелиминарни корак у припреми протеина за технику електрофорезе. Распон пХ код којег делује протеиназа К је прилично широк (2,0 до 12,0), са оптималним пХ између 7,5 и 12,0, а његова изоелектрична точка је 8,9. Као што се може приметити, он је активан у веома широком опсегу пХ.

Друга карактеристика која се истиче у протеинази К је његова стабилност у присуству високих температура (50 - 60 ° Ц).

Ензиматска активност

Протеинази К треба присуство калцијумовог јона, иако то не утиче на његову активност, ако је неопходно да се одржи његова стабилност.

Да би протеиназа К обавила комплетну дигестију супстрата, потребно је приближно време контакта између 5 минута и 2 сата..

Међутим, у том смислу, Даза ет ал., Упоређивале су чистоћу ДНК добијене у неколико наврата изложености протеинази К, и закључили да продужена инкубација (до 24 х) значајно побољшава квалитет ДНК.

Сада, у односу на концентрацију која се користи за ензим протеиназе К у различитим протоколима, може се рећи да је веома различит.

Може се користити од врло ниских концентрација (5 μг / мл) до концентрација од 500 μг / мл. Најчешћи радни опсег се креће у распону од 50-100 μг / мл, посебно за варење протеина и инактивацију нуклеазе. Иако је потребна концентрација од 2 мг / мл за третман ткива.

Апплицатионс

Његове апликације су веома широке и могу се резимирати у следећем:

-Користи се у дигестији протеина и екстракцији ДНК помоћу неколико метода као што су: исушивање, ПК-СДС, цетил-триметил амонијум бромид (ЦТАБ), модификовани калијум ацетат и екстракција са натријум јодидом..

-Инактивација нуклеаза (РНазе и ДНазе).

-У хибридизацијској техници ин ситу (ХИС), да помогне у ослобађању нуклеинске киселине, поред елиминисања нежељених протеина.

-Протеин модифицатион.

-На нивоу истраживања, у разним студијама.

Предности протеиназе К

Неколико компаративних студија је спроведено међу техникама екстракције ДНК коришћењем Протеиназе К, са другима који га не користе и сви закључују да постоје веће користи када се користи ензим. Међу предностима могу се споменути:

-Добија се високо квалитетна и чистоћа високе молекулске масе.

-Екстрахована ДНК је стабилна до 3 месеца.

Екстрахована ДНК се може користити у следећим техникама: Соутхерн блот, ланчана реакција полимеразе (ПЦР), електрофореза, између осталих.

Протеини резистентни на протеиназу К

Различита истраживања су закључила да су приони (абнормални ПрПСц токсични протеини) диференцирани од ПрПЦ протеина (нативни) зато што су отпорни на дејство протеиназе К, док су ПрПЦ осетљиви на њихово дејство..

Други аутори су описали да у структури ПрПСц постоје осетљиви делови и други резистентни на протеиназу К. Међутим, оба дела су једнако токсична и инфективна..

С друге стране, Бастиан и сарадници су 1987. изоловали 4 протеина од 28, 30, 66 и 76 кда из врсте Спиропласма мирум. Сви су били отпорни на дејство протеиназе К и такође су имали унакрсну реакцију са неким прионима.

Познато је да ова врста може изазвати катаракте и важна неуролошка оштећења, а због научних налаза Бастиана, између осталог, учињен је покушај да се овај микроорганизам повеже са трансмисивним спонгиформним енцефалопатијама..

Међутим, етиологија ове дегенеративне неуролошке патологије и данас се приписује прионима.

У том смислу, Бутлер и сарадници су 1991. идентификовали и окарактерисали класу протеина отпорног на протеиназу од 40 Кда из два соја Мицопласма хиорхинис. Овај патоген утиче на свиње, заразе њихова ткива, али у овом случају није било унакрсне реакције са тестираним прионима.

Потребно је више истраживања да би се разјасниле многе непознанице о томе.

Референце

  1. Бастиан Ф, Јеннингс Р и Гарднер В. 1987. Антисерум за сцрапие-асоциран фибрил протеин унакрсно реагује са Спиропласма мирум фибрил протеин. Ј. Цлин. Мицробиол. 25: 2430-2431.
  2. Даза Ц, Гуиллен Ј, Кинг Ј, Руиз В. Процена методе екстракције и пречишћавања ДНК из мишићног ткива фиксираног у формалдехиду од неидентификованих лешева.  Мед Магазине, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Бутлер Г, Котани Х, Конг Л, Фрицк М, Еванцхо С, Станбридге Е, и Мцгаррити Г. Идентификација и карактеризација протеина отпорних на протеину у члановима класе моликула. Инфецтион анд Иммунити, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. Лопез М, Ривера М, Виеттри М, Ларес М, Мороцоима А, Херрера Л, ет ал. Поређење два протокола за издвајање ДНК Трипаносома црузи гајен у аксенском медију. Рев. Перу. Мед. Екп. Публиц Хеалтх  2014; 31 (2): 222-227. Доступно на: сциело.орг
  5. Јименез Г, Виллалобос М, Јименез Е и Палма В. Одређивање ефикасности пет протокола за екстракцију ДНК из парафинског материјала за молекуларне студије. Рев Мед Унив Костарика. 2007; 1 (1): 10-19.