Карактеристике и припрема бактеријског размаза
Тхе бактеријски размаз је продужетак у облику танког филма суспензије бактеријских микроорганизама који се изводи на транспарентној стакленој плочи или плочицама, за посматрање под оптичким микроскопом.
Проширење у облику филма се врши како би се микроорганизми што више одвојили, јер ако су груписани, посматрање није јасно..
У проучавању бактеријских култура користе се технике за припрему размаза, фиксирање и бојење како би се боље анализирале. Због мале величине микроорганизама, неопходна је употреба оптичког микроскопа за његово посматрање.
Оптички микроскопи су неопходни инструменти за посматрање мрља. Они користе оптичка сочива и светлост која омогућава визуализацију узорака са великим повећањем величине.
Уопштено говорећи, живе ћелије немају структуре које су углавном обојене, гледане кроз оптички микроскоп, оне су безбојне, транспарентне узорке, и показују врло мало унутрашњег контраста и са својим окружењем.
Посматрање са једноставним светлосним микроскопом, без употребе помоћних техника бојења, веома је ограничено и користи се само у неким случајевима, као у посматрању кретања микроорганизама..
Да би се оптимално посматрали микроорганизми, мора се постићи равнотежа између контраста и резолуције. Детаљи ћелија не могу се посматрати под микроскопом, чак и при високој резолуцији; употреба боја је потребна кроз технике бојења, које обезбеђују контраст за посматрање.
Индек
- 1 Карактеристике квалитетног бактеријског размаза
- 1.1 Одличан контраст
- 1.2 Добро поправити
- 1.3 Добро бојење
- 2 Припрема
- 2.1 А. Фротис
- 2.2 Б. Фиксација
- 2.3 Ц. Једноставно бојење
- 2.4 Д. Дефинитивно очување размаза
- 3 Референце
Карактеристике квалитетног бактеријског размаза
Одличан контраст
Да би се постигао одличан контраст, називају се софистицирани микроскопи микроскоп са фазним контрастом, диференцијалном интерференцијом и микроскопом у тамном пољу. Овај тип микроскопа се користи за посматрање бактеријских структура, као што су омоти и филаменти, између осталих.
Бојење је једноставна техника за повећање контраста који се постиже јасним микроскопом. У овој техници могу се користити различите боје које значајно побољшавају посматрање под микроскопом.
Мрље се праве директно на размазима или продужетцима суспензија микроорганизама на слајдовима, претходно осушене и фиксиране.
Гоод фик
Фиксација је техника која се користи за очување станичних структура; узрокује инактивацију микроорганизама и адхезију на стакло слајда. Постоје различити третмани фиксације: фиксација топлоте и хемијска фиксација.
Фиксација топлоте
То је метода која се највише користи у посматрању бактеријског размаза. Техника се састоји од пропуштања бактеријске суспензије размаза пламеном упаљача. Ова техника је у стању да сачува спољашњу морфологију бактерија, али уништава њихове унутрашње структуре.
Цхемицал фикатион
Хемијска фиксација користи хемикалије у конзервацији, као што су формалдехид или формалдехид, етанол и сирћетна киселина, између осталих. Предност употребе хемијских средстава за фиксирање је у томе што се постиже очување унутрашњих ћелијских структура микроорганизама.
Гоод стаининг
Најчешћи поступци за бојење претходно исушеног и фиксираног размаза су позитивно или једноставно бојење, диференцијално бојење и негативно бојење. Постоје и посебне технике за бојење посебних ћелијских структура (капсула, спора, флагела).
Позитивно бојење или једноставно бојење
Позитивна или једноставна боја је најчешће коришћена техника за размазивање мрља. Користи боје које имају способност да се вежу за одређене микробне структуре, дозвољавајући им да се посматрају под микроскопом.
Ове боје имају хромофорне групе (обојени део) у својој хемијској структури, са наизменичним двоструким везама и једноставним везама (коњугацијом). Ове везе могу са своје стране успоставити јонске или ковалентне везе са неким ћелијским структурама.
Боје које се користе за позитивно или једноставно бојење су углавном хемијски деривати анилин (обојене органске соли).
С друге стране, међу бојама можемо наћи неке са базним пХ, а друге са киселим пХ.
Басиц цолорантс
У основним бојама, хромофорска група има позитиван електрични набој. Велика већина прокариотских микроорганизама има неутрални унутрашњи пХ, а њихова ћелијска површина је негативно набијена. Кроз ову електростатичку интеракцију, хромофор се везује за ћелију и обоји је.
Примери основних боја су метиленско плаво, љубичасти кристали, малахитно зелени, основни фусцин, сафранин, између осталих.
Ацид диес
У киселим бојама хромофорска група има негативни електрични набој. Они се користе за бојење протеина са позитивно наелектрисаним амино групама. Примери киселих боја су киселина фусцин, ружа Бенгал, Конго црвена и еозин.
Дифферентиал стаининг
Техника диференцијалног бојења састоји се од примене две боје различитих боја или интензитета, како би се разликовали различити микроорганизми под микроскопом. Бојење са Грам бојом и киселинско-алкохолном отпорношћу су најчешће коришћене диференцијалне мрље у бактериологији.
Грам боја се користи као прелиминарни тест за познавање облика, величине, групирања ћелија, поред типа ћелијског зида. Кроз Грам тест на боју, бактерије са ћелијским зидом су класификоване као Грам-позитивне бактерије и Грам-негативне бактерије.
Негативно бојење
У овој техници се користе хемијске боје које не продиру у унутрашњост ћелија, али то чине медијум у којем се микроорганизми појављују као црна позадина.
У техници негативног бојења, размаз се прави капљицом суспензије кинеског мастила или нигрозина, који након омогућавања сушења на собној температури формира филм непрозиран за пролаз светлости. На овај начин, микроорганизми се посматрају као свијетле форме на тамној позадини.
Препаратион
А. Мрља
1.- Добро оперите слајдове, осушите упијајући папир и означите их. На етикети мора бити наведен садржај препарата, датум и име особе која га је обрадила.
2. - Осветлите упаљач и стерилизујте петљу за инокулацију у пламену док се не загреје.
3.- Оставите ручку хладном.
4.- Узмите епрувету бактеријске културе, уклоните поклопац и брзо прођите кроз отвор цијеви близу пламена упаљача (пламен)..
5. Увести петљу за инокулацију у епрувету која садржи бактеријску културу и узети узорак.
6. Ако је култура у течном медију, ставите узорак узет са дршком у средину клизача и пажљиво га раширите у кругу од приближно 2 цм у пречнику..
7.- Поново стерилисати петљу за инокулацију.
8. - Оставите да се мрља у зраку.
9.- Поновите кораке 3 до 8 три пута.
10. Ако је култура у чврстом медију, на слајд треба претходно ставити дестиловану воду. Ово је урађено да се меша мали узорак културе узет са дршком инокулације, према индикацијама корака 2 до 5 (услови асепсе).
11.- Продужите разблажени узорак са капљицом воде на слајд и поновите три пута.
Б. Фиксација
1.- Додати сувом размазу - произведеном из култура у течној средини - две капи метанола или апсолутног етанола..
2. - Дозволите сушење на ваздуху даље од упаљача.
3. Ако се мрља појављује у култури у чврстом медију, суви размаз се фиксира топлотом, пролази 2 до 3 пута брзо кроз најтоплију област пламена упаљача..
4. - Додирните доњи део бриса дорзалним делом леве руке (за десну руку, иначе користите десну руку) и проверите да ли је хладно.
Ц. Једноставно бојење
Додати 2 капи одабране боје у размаз и оставити да делује у времену које је потребно у специфичним протоколима сваке боје (обично између 1 и 5 минута).
Неке боје захтијевају кориштење топлине за њихово активирање, у којем случају је потребно бити врло опрезан при загријавању клизача у пламену упаљача (манипулирати га пинцетом и избјегавати врење). Прегријавање размаза може уништити ћелије које желите да посматрате.
3.- Уклоните вишак боје прањем дестиловане воде из пикета. Уклоните воду за прање лаганим куцкањем клизача по ивици, нагнутом на радном столу.
4.- Дозволите сушење на ваздуху.
5.- У зависности од врсте посматрања, у овој фази се користи или не покрива прекривач. Покривач штити и чува размаз. Ако се у овој фази направи опажање потапањем у уљу, не користи се покривач, али се размаз не може сачувати.
Д. Дефинитивно очување размаза
1.- Потопите размаз узастопно у свако од наведених раствора, најмање 5 минута. Сврха ових "купки" је да остави мрљу потпуно дехидрирану. Сваки реагенс мора да се испразни, пре уношења размаза у следећу купку.
Редослед купатила за дехидрацију је следећи:
- Етанол 70%
- 95% етанол
- Чисти ацетон
- Мешати ацетон-ксилол 1: 1
- Ксилол
Затим омогућите сушење на ваздуху.
2. Монтирајте покривач, пожељно 22 × 22 мм, користећи канадски балзам или друга средства за склапање.
Референце
- Бриггс, Г. (1965). Узрочни фактори у микробиолошким лабораторијским несрећама и инфекцијама. УС Арми Биологицал Лабораториес. Форт Детрицк.
- Цаппуцино, Ј.Г. и Велцх, Ц.Т. (2017). Микробиологија: приручник за лабораторију. Пеарсон.
- Холт, Ј.Г. Едитор (1977). Краћи Бергеијев приручник о детерминативној бактериологији. 8тх Балтиморе: Тхе Виллиамс и Вилкинс Цо.
- Јохнсон, Т.Р. и Цасе; Ц.Л. (2018). Лабораторијски експерименти у микробиологији. Пеарсон.
- Тилле, П. (2017). Диагностиц Мицробиологи. 14тх Ст. Лоуис, США: Елсиевер, Инц.