Функције рестрикционих ензима, механизам деловања, типови и примери

Тхе рестрикциони ензими то су ендонуклеазе које користе одређене археје и бактерије да инхибирају или "ограниче" ширење вируса унутар њих. Посебно су уобичајене код бактерија и део су њиховог одбрамбеног система против страних ДНК познатих као рестрикциони / модификациони систем.

Ови ензими катализирају резање дволанчане ДНК на специфичним локацијама, репродуцибилно и без употребе додатне енергије. Већина захтева присуство кофактора као што су магнезијум или други двовалентни катјони, иако неки такође захтевају АТП или С-аденозил метионин.

Ендонуклеаза рестрикције су откривени 1978. Даниел Натханс, Вернер Арбер и Хамилтон Смитх, који је добио Нобелову награду за медицину за његово откриће. Њено име потиче од тела које обично посматраном први пут.

Такви ензими се широко користе у развоју метода клонирања ДНК и других стратегија молекуларне биологије и генетског инжењеринга. Његове карактеристике препознавања специфичних секвенци и способности да се сијече секвенце близу мјеста препознавања чине их моћним алатима у генетичким експериментима.

Фрагменти генерисани рестрикционим ензимима који су деловали на одређени молекул ДНК могу се користити за стварање "мапе" оригиналног молекула коришћењем информација о местима где је ензим пресекао ДНК..

Неки рестрикциони ензими могу имати исто место препознавања у ДНК, али они га не морају нужно резати на исти начин. Дакле, постоје ензими који праве резове који остављају тупим крајевима и ензимима који сече резање кохезивних циљева, који имају различите примене у молекуларној биологији.

Тренутно постоје стотине различитих комерцијално доступних рестрикционих ензима, које нуде различите комерцијалне куће; ови ензими раде као "обичајне" молекуларне маказе за различите сврхе.

Индек

• 1 Функције
• 2 Механизам дјеловања
• 3 Типови
  • 3.1 Тип И рестрикционих ензима
  • 3.2 Тип ИИ рестрикционих ензима
  • 3.3 Тип ИИИ рестрикциони ензими
  • 3.4 Тип ИВ рестрикционих ензима
  • 3.5 Тип В рестрикциони ензими
• 4 Примери
• 5 Референце

Функције

Рестрикциони ензими служе супротној функцији полимераза, јер хидролизују или прекидају естерску везу унутар фосфодиестерске везе између суседних нуклеотида у нуклеотидном ланцу.

У молекуларној биологији и генетичком инжењерингу они су широко коришћени алати за конструкцију вектора експресије и клонирања, као и за идентификацију специфичних секвенци. Они су такође корисни за изградњу рекомбинантних генома и имају велики биотехнолошки потенцијал.

Недавни напредак у генској терапији тренутно користи рестрикционе ензиме за увођење одређених гена у векторе који су средства за транспорт таквих гена у живе ћелије, и који вероватно имају способност да буду убачени у ћелијски геном за извођење сталне промене.

Механизам дјеловања

Рестрикциони ензими могу да катализују сечење дволанчане ДНК, мада неки могу да препознају једноланчане секвенце ДНК, па чак и РНК. Рез се врши након препознавања секвенци.

Механизам дјеловања састоји се у хидролизи фосфодиестерске везе између фосфатне групе и деоксирибозе у окосници сваког ланца ДНА. Многи ензими су у стању да секу на истом месту које препознају, док други режу између 5 и 9 пари база пре или после њега..

Нормално су ови ензими резани на 5 'крају фосфатне групе, што доводи до фрагмента ДНК са 5' фосфорилним крајем и терминалним 3 'хидроксилним крајем.

Пошто протеини не долазе у директан контакт са места препознавања у ДНК, треба транслоцирају сукцесивним понављањем до одређене локације, можда путем "клизање" механизама на ДНК ланцу.

Током ензиматског резања, фосфодиестерска веза сваког од ланаца ДНК је позиционирана унутар једног од активних места рестрикционих ензима. Када ензим напусти место препознавања и сечења, то чини преко неспецифичних прелазних асоцијација.

Типови

Тренутно је познато пет типова рестрикционих ензима. Испод је кратак опис сваког од њих:

Тип И рестрикционих ензима

Ови ензими су велики пентамерни протеини са три подјединице, рестрикција, метилација и други за препознавање секвенци у ДНК. Ове ендонуклеазе су мултифункционални протеини способни да катализују реакције рестрикције и модификације, имају активност АТПазе и такође ДНА топоизомеразу.

Ензими овог типа били су прве ендонуклеазе које су откривене, прочишћене су први пут 1960-их година и од тада су истраживане са великом дубином..

Ензими типа И нису широко коришћени као биотехнолошки алат, јер место сечења може бити на променљивој удаљености од 1.000 парова база од места препознавања, што их чини непоузданим у смислу експерименталне репродуктивности..

Тип ИИ рестрикционих ензима

То су ензими састављени од хомодимера или тетрамера који режу ДНК на одређеним местима између 4 и 8 бп дужине. Ова места сечења су типично палиндромска, тј. Препознају секвенце које се читају на исти начин у оба смера.

Многи ограничење ензими типа ИИ бактерија цлеаве ДНК када препознају своју спољну карактер, јер нема типичне модификације које би требало да имају свој ДНК.

Ово су најједноставнији рестрикциони ензими јер не захтевају ниједан кофактор осим магнезијума (Мг +) да препознају и пресеку ДНК секвенце.

Тачност рестрикционим ензимима типа ИИ у једноставним секвенци препознају и исећи ДНК у дефинисаним позицијама чини један од највише користи и неопходан у већини грана молекуларне биологије.

Унутар групе рестрикционих ензима типа ИИ су вишеструки подразреди класификовани према одређеним особинама које су јединствене за сваку од њих. Класификација ових ензима врши се додавањем слова абецеде, од А до З, по имену ензима..

Неки од подкласа које су најпознатији по својој корисности су:

Подкласа ИИА

Они су димери различитих подјединица. Они препознају асиметричне секвенце и користе се као идеални прекурсори за генерисање ензима за сечење.

Субцласс ИИБ

Састоје се од још једног димера и пресецају ДНК са обе стране секвенце препознавања. Резали су обе нити ДНК у опсегу парова база изван места препознавања.

Субцласс ИИЦ

Ензими овог типа су полипептиди са функцијом дељења и модификације ДНК ланаца. Ови ензими режу обе нити асиметрично.

Субцласс ИИЕ

Ензими ове поткласе се највише користе у генетичком инжењерингу. Они имају каталитичко место и генерално захтевају алостерични ефектор. Ови ензими морају да ступају у интеракцију са две копије њиховог низа препознавања да би се постигао ефикасан рез. Унутар ове подкласе су ензими ЕцоРИИ и ЕцоРИ.

Тип ИИИ рестрикциони ензими

Рестрицтион ендонуцлеасе тип ИИИ се састоје само од две подјединице, један је одговоран за признавање и ДНК модификације, док су остали ручке сечење секвенцу.

Ови ензими захтевају два кофактора за њихово функционисање: АТП и магнезијум. Рестрикцијски ензими овог типа поседују два асиметрична места препознавања, транслоцирају ДНК на АТП-зависни начин и пресецају је између 20 до 30 бп поред места препознавања..

Тип ИВ рестрикциони ензими

типа Ензими ИВ се лако идентификовани као секу ДНК марака метилацију, они формирају неколико различитих подјединица које ручица препознају и прошао ДНК секвенце. Ови ензими користе ГТП кофактора и двовалентни магнезијума.

Специфична места за сечење укључују нуклеотидне ланце са остацима метилираног или хидроксиметилованог цитозина у једној или оба ланца нуклеинских киселина.

Тип В рестрикциони ензими

Ова класификација групише ензиме типа ЦРИСПЕР-Цас, који идентификују и пресецају специфичне ДНК секвенце из организама који нападају. Цас ензими користе ланац ЦРИСПЕР синтетизованог РНК који препознаје и напада организме који нападају.

Ензими класификовани као тип В су полипептиди структурирани ензимима типа И, ИИ и ИИ. Могу изрезати делове ДНК скоро сваког организма и са великим распоном дужине. Њихова флексибилност и лакоћа употребе чине ове ензиме једним од најчешће коришћених алата у генетском инжењерингу данас заједно са ензимима типа ИИ..

Примери

За детекцију полиморфизама ДНК коришћени су рестрикциони ензими, посебно у истраживањима популационе генетике и еволуционих студија употребом митохондријалне ДНК, да би се добиле информације о брзини нуклеотидних супституција..

Тренутно, вектори који се користе за трансформацију бактерија са различитим циљевима имају мултиклонашка места где се налазе места за препознавање за вишеструке рестрикционе ензиме..

Међу овим ензимима, најпопуларнији су ЕцоРИ, ИИ, ИИИ, ИВ и В, добијени и описани први пут. Е. цоли; ХиндИИИ, од Х. инфлуензае и БамХИ Б. амилоликуефациенс.

Референце

1. Бицкле, Т.А., & Кругер, Д.Х. (1993). Биологија рестрикције ДНК. Мицробиологицал Ревиевс, 57(2), 434-450.
2. Боиавал, П., Моинеау, С., Ромеро, Д.А., & Хорватх, П. (2007). ЦРИСПР Пружа стечену отпорност на вирусе у прокариотима. Сциенце, 315(Март), 1709-1713.
3. Гоодселл, Д. (2002). Молекуларна перспектива: Рестрикционе ендонуклеазе. Матичне ћелије Основе лечења рака, 20, 190-191.
4. Халфорд, С.Е. (2001). Хоппинг, јумпинг и лоопинг помоћу рестрикцијских ензима. Трансакције биохемијског друштва, 29, 363-373.
5. Јелтсцх, А. (2003). Одржавање идентитета врста и контрола специације бактерија: нова функција система за ограничавање / модификацију? Гене, 317, 13-16.
6. Кребс, Ј., Голдстеин, Е., & Килпатрицк, С. (2018). Левинови Гени КСИИ (12 ед.). Бурлингтон, Массацхусеттс: Јонес & Бартлетт Леарнинг.
7. Ли, И., Пан, С., Зханг, И., Рен, М., Фенг, М., Пенг, Н., ... Она, К. (2015). Употреба ЦРИСПР-Цас система типа И и ИИИ за уређивање генома. Нуцлеиц Ацидс Ресеарцх, 1-12.
8. Лоенен, В. А.М., Дриден, Д.Т.Ф., Ралеигх, Е.А., & Вилсон, Г.Г. (2013). Тип И рестрикционих ензима и њихових рођака. Нуцлеиц Ацидс Ресеарцх, 1-25.
9.  Натханс, Д., & Смитх, Х. О. (1975). Ендонуклеазе рестрикције у анализи и реструктурирању молекула ДНК. Анну. Рев. Биоцхем., 273-293.
10.  Неи, М., & Тајима, Ф. (1981). Полиморфизам ДНА који се може детектовати рестрикционим ендонуклеазама. Генетика, 145-163.
11.  Пингоуд, А., Фукреитер, М., Пингоуд, В., & Венде, В. (2005). Целлулар анд Молецулар Лифе Сциенцес Тип ИИ рестрикционе ендонуклеазе: структура и механизам. ЦМЛС Целлулар анд Молецулар Лифе Сциенцес, 62, 685-707.
12.  Робертс, Р. (2005). Како су рестрикциони ензими постали носиоци молекуларне биологије. ПНАС, 102(17), 5905-5908.
13.  Робертс, Р.Ј., & Мурраи, К. (1976). Рестрикционе ендонуклеазе. Критички осврти у биохемији, (Новембар), 123-164.
14.  Стоддард, Б.Л. (2005). Структура и функција ендонуклеазе. Квартални прегледи биофизике, 1-47.
15.  Тоцк, М. Р., & Дриден, Д. Т. Ф. (2005). Биологија рестрикција и анти-рестрикција. Цуррент Опинион ин Мицробиологи, 8, 466-472. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.миб.2005.06.003
16.  Вилсон, Г. Г., & Мурраи, Н.Е. (1991). Системи ограничења и модификације. Анну. Рев. Генет., 25, 585-627.
17.  Ву, З., & Моу, К. (2016). Геномски увид у вируленцију Цампилобацтер јејуни и популациону генетику. Инфецт Дис. Трансл. Мед., 2(3), 109-119.
18.  Иуан, Р. (1981). Структура и механизам мултифункционалних рестрикционих ендонуклеаза. Анну. Рев. Биоцхем., 50, 285-315.